關于質粒轉化
2023-03-08育兒質粒轉化的具體過程,鑒定方法
大家好，小編為大家解答質粒轉化的具體過程,鑒定方法的問題。很多人還不知道常用的質粒轉化方法有哪些，現在讓我們一起來看看吧！
質粒轉化步驟
質粒的轉化，滿滿干貨
原理：在受體細胞經過化學試劑或者電擊處理等方法處理后，受體細胞的膜通透性發生改變，質粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內而實現擴增。
感受態細胞：是指細胞自然或者經過誘導處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態。在基因工程中，用于轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便于外源基因或載體進入感受態細胞。由于細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
質粒的轉化主要包含
Ⅰ感受態細胞制備
Ⅱ質粒DNA轉化
Ⅲ質粒DNA的提取
（Ⅰ）感受態細胞制備
1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種于3ml LB培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。
2）將該菌懸液按照1:100轉接到液體培養基中，100ml，37℃振蕩擴大培養，2~3h。當培養液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數值為0.3-0.5時停止培養。
3）培養好的菌液轉移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。
4）棄掉上清，管口倒置以便培養液棄除干凈。
5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉淀細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率）
6）4℃離心10min（4000r/min）。
7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態細胞制成。
8）可直接用于實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。
（Ⅱ）質粒DNA的轉化
1）取100ul新鮮制備的感受態細胞，加入質粒1ul DNA混勻,同時設置對照組（未加質粒，未加受體菌，已知具有轉化活性的DNA）。
冷凍的感受態細胞要在冰上解凍，待管中最后一點冰融化后，迅即加入DNA. 解凍感受態細胞溫度高于0℃，會降低轉化效率。
2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短于30min ,可能影響轉化率。然后迅速冰浴2min。
3）向離心管加800ulLB液體培養基，37℃振蕩培養1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠對于細胞恢復和抗生素抗藥性表達具有最佳效果。
4）取適當（50ul）的復蘇細胞培養液，涂布在含抗性的選擇性培養基上，將培養皿放置在37℃恒溫培養箱中，正置30min。等菌液完全被培養基吸收后，倒置培養皿，在37℃恒溫培養箱中，培養12~16h，出現菌落。
5）菌落結果：
① 無菌落
失敗或者培養條件不充分
② 布滿菌落,
呈苔樣，失敗。可能是抗生素濃度不夠或失敗。出現大菌斑，大多是由于霉菌污染所致。
③ 布滿菌落
濃度太高，失敗
④ 出現菌落
符合要求
Ⅲ）質粒DNA的提取
質粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用堿裂解法提取。目前已研發出多種質粒提取試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產品操作說明操作即可。不過對于其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。
各廠家提供的試劑盒中試劑不盡相同，一般的提取純化試劑盒，主要包括以下試劑：
A. 細胞懸浮試劑: 主要作用是將菌體細胞懸浮起來。菌體懸浮不完全會導致裂解不完全，質粒的提取純度和得率都會下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常選用Tris-HCl作為體系中pH穩定緩沖液。EDTA，金屬離子螯合劑可以和細菌體內的金屬離子結合而DNase的活性受到抑制。有的會有葡萄糖，可用來增加溶液粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉淀時間。
B. 細胞裂解試劑：主要作用是裂解細胞，通過堿溶液的作用破壞細胞膜結構，使其雙層膜結構改變，而導致細胞裂解。一般由一定濃度的NaOH和SDS組成。SDS的作用與后期中和過程中清除掉蛋白質等細胞雜質有關系。此步驟中需要注意的是，堿溶液的作用時間不能太長，也不可劇烈離心管，反之會導致堿破壞基因組DNA，導致同等大小的基因組DNA被提純，造成污染。
C. 中和試劑：主要作用使中和掉細胞裂解試劑中的堿性物質，并去除掉其中的蛋白等雜質物質。組份有醋酸鉀和醋酸，或者乙酸鉀和冰乙酸。
D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的鹽離子。DNA被試劑盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脫掉多余的鹽離子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇對后續酶切和測序反應會有影響，因此在后續洗脫DNA前，必須完全清除柱子中的乙醇。
E. 洗脫Buffer: 主要作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。
1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通過重力的作用，使平衡buffer都流出。
2.細胞收獲：對于高拷貝質粒（培養液中，>2μg DNA/mL)，吸取1-3ml培養液,離心去上清；對于低拷貝質粒（培養液中，<2μg DNA/mL)，吸取10-15ml培養液，離心去上清。
3. 細胞懸浮：加0.4mL的細胞懸浮液(containing RNase A)懸浮細胞，并使其混勻。
4. 細胞裂解：加入0.4mL細胞裂解液，通過上下顛倒帶蓋子管子5次使其輕輕混勻，不要渦旋，之后在室溫下放置5min.。
5. 中和：加入0.4mL的中和試劑，立即混合均勻。當大的細胞顆粒被處理后，可能會進行更劇烈的搖動。但是，不要渦旋！~12,000xg離心混合物10min. 如果是采用的4°離心，上清液需要恢復到室溫，再加入到柱子中。
6. 裝柱：吸取步驟5中的上清液到平衡柱中。讓混合液通過重力的作用流出，棄掉流出液。
7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脫柱子量次。每次清洗讓清洗液通過重力的作用流出，棄掉流出液。
8. 質粒DNA洗脫：加入0.9mL的Elution Buffer。讓Elution Buffer通過重力的作用流出。不要強行弄出里面的液體。
9. 質粒DNA沉淀：加入0.63mL異丙醇去析出，混勻，~12,000xg at/4°C離心30min。小心的去掉上清，之后風干10分鐘。
10. DNA純化：將管子中的DNA溶解到TE buffer中。將這些溶液轉移到新管中。
重組質粒鑒定的方法：
① 雙酶切后跑電泳；直接DNA電泳可判斷整個DNA重組質粒是否正確。② PCR(插入片段在2kb以下時)，然后電泳。
③ 送公司測序（最為準確的鑒定方式）。
影響轉化效率的因素：
① 細胞狀態和細胞密度: 培養菌最好選用傳代次數少，且保存于-70℃或者-20℃。不要使用經過多次轉接或者保存于4℃環境中培養菌。細胞生長密度以剛進入對數其為最好，可通過檢測培養液的OD600值來判斷，密度過高或者不足，都會影響轉化效率。通常DH5α菌株在OD600的值為0.5左右，細胞密度在5*107個/ml左右比較合適。密度過高或者不足均會影響轉化效率。
② 質粒的質量和濃度：轉化的質粒DNA中，超螺旋狀態的質粒，轉化效率最好。在一定濃度范圍內，轉化的效率與添加質粒的濃度成正比。不過在添加的質粒的量和體積過大的時候，轉化效率也會降低。質粒的分子量越大，通常來說轉化率也會降低。
③試劑的質量：轉化過程中所用的試劑，如氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率。
④防止雜菌和DNA污染：實驗需要在無菌條件下進行，所用的儀器和試劑均需要滅菌處理，并防止在實驗過程中引入其他污染。
⑤培養過程的條件：培養瓶中培養基的量關乎到菌體生長過程中的能量代謝。通常來說厭氧環境做出來的感受態的轉化效率較低。建議500ml三角瓶液體培養基量不超過100ml, 250ml三角瓶液體培養基量不超過50ml. 培養基的pH值要適宜，接種前一般pH值在6.8-7.2，等培養結束后可以再測一下pH值最好在6.5以上（不低于6.0），表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好。培養基中的各種離子和溫度，也對形成好的感受態有關系。
幾種擴增常用感受態細胞：
① 普通骨架載體cDNA產品
DH5α：常用于質粒克隆，可用于藍白斑篩選。
TOP10：適用于高效的DNA克隆和質粒擴增，能夠保證高拷貝質粒的穩定遺傳。
TG1: 生長速度快，常用于噬菌體的制備，同時也可用于普通質粒的構建。
CopyCutter：適用于有毒克隆。
② 慢病毒載體質粒：
Stbl3: 是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率。
Stable（NEB）：可用于逆轉錄病毒/慢病毒載體系統擴增。
質粒轉化成功后的意義
質粒轉化是指將外源質粒導入原核細胞的過程。
質粒轉化是指將外源質粒導入原核細胞的過程。其中的轉化是指將外源的脫氧核糖核酸分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。
將質粒脫氧核糖核酸導入細菌的過程稱為轉化。此感受態細菌細胞在氯化鈣低滲溶液中膨脹為球狀。質粒脫氧核糖核酸與氯化鈣形成抗磷酸鈣復合物黏附于細菌表面，經42攝氏度短時間的熱沖擊處理，促進細胞吸收脫氧核糖核酸復合物。在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。被轉化的細菌中，外源基因得到表達。在選擇性培養平板上，可選出所需的轉化子。
關于質粒轉化
1.電擊轉化時通過瞬時高壓使細胞表面出現微小的孔洞，從而使外源DNA能通過孔洞進入到細胞里面，一般適用于革蘭氏陽性細菌或者真核微生物；
熱激轉化是使用鈣鹽或者鎂鹽溶液在低溫狀態下處理細胞使其處于感受態狀態，然后通過短時熱激使其吸入外源DNA片段，主要應用于革蘭氏陰性細菌。
這些我想你應該懂的。我就不贅述了。
2.大腸桿菌作為革蘭氏陰性細菌，使用一般的化學轉化即熱激轉化就可以了，為何要勞神費力使用電轉化？轉化的目的不就是簡單而方便為原則么？正所謂殺雞焉用牛刀？
希望我的回答對你有幫助。
質粒轉化可以不涂板嗎
質粒轉化是將外源DNA（比如質粒）引入細胞內的一種方法，主要有電穿孔法、熱激轉化法、鈣離子共沉淀法等。其中，一些方法需要涂覆反應物于載體表面，從而增加外源DNA與宿主細胞之間的黏附，促進質粒的轉化。但并非所有的質粒轉化都需要涂板。以下是幾種常用的質粒轉化方法：
1. 電穿孔法：該方法通過電場作用使得宿主細胞膜發生永久性孔洞，從而使外源DNA能夠進入細胞。不需要涂板。
2. 熱激轉化法：該方法利用高溫和低溫交替處理使菌體迅速膨脹收縮，改變了菌壁通透性，從而將外源DNA引入細胞內。不需要涂板。
3. 直接電轉化：該方法將裂解后的細胞和質粒直接暴露于電場中，并產生足夠大的電場強度使質粒穿過宿主細胞的細胞膜，以完成質粒的轉化。不需要涂板。
需要注意的是，每種質粒轉化方法都有其適用范圍和優缺點，具體使用時需要根據實驗需求進行選擇。
質粒轉化效率的影響因素,以及如何提高質粒轉化效率?
列幾個影響因素：
1,沒有3‘端突出端
2,存在嘧啶二聚體,不能連接。
3,插入片段與載體比例不理想。
4,培養基放置時間過長
等等
消除上面的影響因素可以提高質粒轉化效率,另外,用好點的載體可以提高轉化效率。
關于質粒載體轉化時如果使用同種質粒載體那么在轉化過程中會不會有多個質粒載體進入轉化子里呢？
會的。在最初的轉化時，一個宿主菌內很可能轉進去多個載體。
但是最后能在宿主菌中穩定復制并存在的，只有一種載體，或者說，復制子不互相干擾的載體才能穩定共存。
質粒的轉換的方法有哪些？質粒轉化后如何篩選？
轉化的方法：最常用的是感受態法，包括熱激和電轉化等，轉染不是轉化，這是不同的概念。
轉化后，可以根據質粒上帶有的某種特殊基因的表達來鑒定菌落，最常用的有：抗藥性基因的表達，比如質粒帶有氨芐抗性基因，能在AMP平板上長的一般可以初步判斷為轉化成功的菌；還有就是顯色篩選，比如質粒上的LacZ基因表達，間接促使添加了X-gal的培養基變藍，綠色熒光蛋白基因表達后菌落發熒光等。
請教:微生物質粒(化學)轉化機制,結交這方面的同好.
先糾正一下，環磷酸腺苷是cAMP而不是cDNA。從提的問題來看，你應該不具備什么分子生物學背景。
首先，你將質粒轉化進沙門氏菌的目的何在？一般來說，將外源質粒轉入細胞體內是為了獲取大量繁殖質粒或是測試質粒中克隆DNA的基因功能。而這些工作，基本都可以由模式生物中的E.coli(細菌)和Yeast（真菌）來完成。而這些菌種（因攜帶基因功能不同可分為多種細胞系）均可通過商業途徑得到。而這些商業銷售的菌種均具有易培養轉化效率高的特性。所以，除非你有特殊原因，否則完全沒有將質粒轉入沙門氏菌的必要性。
第二，分子生物學中的質粒轉化并不是經由細菌對細菌途徑進行的，而是直接將質粒轉化入細胞系。質粒要通過商業途徑購買（一次購買后，你便可以通過PCR或者轉入細胞中培養再提取等方法反復獲得），插入你所感興趣的DNA片段后，直接加入菌株中進行轉化，通常來說，轉化中所需加入外源質粒的總量在幾百納克左右。如果在兩種細菌中直接做質粒轉化，轉化效率是非常低的。
第三，如果你使用沙門氏菌做試驗，那么你的選擇性培養基是什么呢？也就是說，你怎么確定你的菌株成功轉化了外源質粒呢？
第四，Saccharomyces cerevisiae（即Yeast）轉化一般多加入PEG后再進行人工誘導（42攝氏度20分鐘），而E.coli的轉化相對簡單，一般來說，只需人工誘導42攝氏度45秒鐘即可。由于沙門氏菌同屬細菌，你可以嘗試最簡單的化學誘導。具體步驟可以參考商業大腸桿菌的質粒轉化。
